PRACTICAS BIOLOGIA MOLECULAR (pGLO) U. Antofagasta

PRACTICA pGLO

OBJETIVOS

Transformar la bacteria E.coli en el Plásmido pGLO por schock térmico.

1.- Etiquetar un tubo de ensayo + pGLO y otro -pGLO. Colocarle el nombre del grupo

         2.-   Con ayuda de una pipeta estéril adicionar 250μl de solución de transformación pGLO.

3.-Colocar los tubos en Hielo

4.-Con un asa estéril, tomar una sola colonia de bacterias de la caja de Petri entregada por la docente. Sumergirla en un tubo de ensayo Pick up the + pGLO solución de transformación. Haga girar el tubo entre el dedo índice y pulgar hasta que toda la colonia este dispersado en la solución de transformación. Coloque el tubo en hielo. Usando una nueva asa estéril, repita para el tubo -pGLO.

5.-Examinar el ADN plasmidico PGLO, bajo luz UV, introducir una asa estéril en la solución de tubo +pGLO y mezclar en el tubo marcado como +pGLO, llevar nuevamente al hielo

6.-Incubar los tubos en hielo por 10 minutos

7.- Etiquetar las placas de agar en la parte inferior

8.-Choque térmico. Usando una gradilla de espuma transferir los dos tubos al baño de maria a42°C por 50 segundos. Luego incubar los tubos nuevamente al hielo por 2 minutos

9.- Posteriormente abrir los tubos y con una pipeta estéril, añadir 250μl de LB caldo, incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.

10.-Usando una pipeta estéril tomar 100μl de cada tubo (+pGLO y pGLO-) sembrar en cada una de las placas correspondiente

11.-  Utilice una nueva asa estéril para cada plato. Separe las suspensiones

uniformemente alrededor de la superficie de la agar patinando rápidamente el plano

superficie de un nuevo bucle estéril de ida y vuelta a través de la superficie de la placa . Una vez realizado las siembras se invierte las placas llevando a incubadora a 37°C por 24 horas.

.

12.-Esta práctica de laboratorio se realizó utilizando como protocolo el kit de transformación bacteriana con pGLO (Bio-rad) para observar en la bacteria E.coli, la proteína de fluorescencia verde. Una vez realizado el procedimiento y trascurrido las 24 horas de incubación de las placas de Petri, estas fueron expuestas a luz Uv para observar la presencia de un pigmento verde que indica la presencia de la proteína fluorescente verde.

Placas de Petri: dos placas marcadas +pGLO y otras –pGLO, después de la incubación a 37°C por 24 horas, se observa en las placas +pGLO crecimiento de colonias medianas, redondas, visiblemente color crema, textura cremosa y sin olor. Las otras dos placas marcadas –pGLO no se observó crecimiento de microorganismos

Placas de Petri, Observadas bajo luz Uv: tres placas marcadas +pGLO (LB/Amp) y otras –pGLO (LB) 7 -pGLO (LB/Amp), se observa pigmentación de las colonias que crecieron en las placas +PGLO (LB/Amp/Ara). 

DISCUSION

En el laboratorio de control a diferentes resultados se observó en cada uno de los cuatro platos. En el la placa +pGLO (LB/Amp/Ara), se observan colonias verdes fluorescentes desarrollados. Esto es porque el gen que codifica para la proteína fluorescente, GFP, está situado cerca del gen de la beta lactamasa en el plásmido PGLO, que protege a las bacterias de la antibiótico ampicilina. Cuando la célula produce beta lactamasa para desactivar la ampicilina, el gen GFP también fue transcrito, produciendo la proteína fluorescente observada.

En la placa LB / amp contiene el blanco de muestra + PGLO, se observaron células no fluorescentes. Mientras que estos genes contenían el plásmido PGLO y el gen GFP no podían expresar el gen GFP, ya que no se hicieron crecer en presencia de arabinosa. Aunque la presencia de ampicilina hace que la célula para transcribir los genes beta lactamasa y GFP, se necesita arabinosa para activar el operón GFP.

Por lo tanto sin arabinosa en el gel de agarosa, GFP no puede ser transcrito y las células no será fluorescente. En la placa de agarosa LB / amp tratado con la muestra -pGLO, no hay células crecieron. Esto es porque sin el plásmido PGLO y el gen beta lactamasa las células no pueden desactivar el ampicilina en el gel. Por lo tanto todas las células fueron exterminados.

Purificación de proteínas

Fase 1.- Concentración bacteriana

1.    A partir de un tubo de ensayo con 2 mL de cultivo LB de Escherichia coli. con una pipeta, se  transfirio 1 mL de cultivo líquido  de E. coli a un Epperdorf, luego se coloco en centrífuga a 10000 rpm durante 5 minutos.

2.-Se descarto el sobrenadante y se observo el pellet bajo luz UV

3.- Se añadio 250 µL de de la solución Buffer TE al tubo. Se resuspendio el precipitado a fondo pipeteando arriba y abajo varias veces.

ç

4.- Se añadio 1 gota de lisozima al pellet para iniciar la digestión enzimática de la pared celular de las bacterias. Luego se mezcló el contenido suavemente  agitando el tubo, colocando la muestra en el congelador

Fase 2: Lisis bacteriana

1.    1.- Se retiró la muestra del congelador y se descongelo utilizando la calidez de la mano. 1.-Luego se colocó el tubo en la microcentrífuga y se sedimento el pellet a 10000 rpm por 5 minutos. Mientras se centrifugaba, se preparó la columna de cromatografía. Se quitó la tapa y el  encaje de la parte inferior de la Columna de HIC. Todo el buffer paso por la columna. (5-3 minutos).

1. 2.-Para la preparación de la columna cromatografía se añadió 2 mL de buffer de equilibración a la parte superior de la columna. Luego se escurrió el amortiguador a 1 mL en la columna. Se tapó la parte superior e inferior y se almaceno la columna a temperatura ambiente.

3.- Después de quitar la muestra de la centrífuga, se examinó el tubo con la luz UV. Utilizando una nueva pipeta, se transfirió 250 µL del sobrenadante en un nuevo eppendorf, luego se añadio 250 µL de buffer binding al sobrenadante.

FASE 3. PURIFICACIÓN CROMATOGRAFICA DE PROTEINAS

1.-Se usaron tres tubos de recogida de 1, 2 y 3 y se coloco los tubos en bastidor de espuma. Se retiro las tapas de la parte superior e inferior de la columna y el lugar la columna en tubo de recogida 1.

2.- Se transfirio 250 µL del sobrenadante sobre la parte superior de la columna. Y se dejó que el sobrenadante gotee por el lado de la pared de la columna. Después de que se detuvo el goteo se transfirio la columna al tubo 2

3.- Con una pipeta, se añadio 250 µL de buffer Wash dejando que todo el volumen fluya en la columna, hasta detenerse el goteo, luego la columna se transfirió al tubo 3 

4.- Se añadio 750 µL de Buffer TE y se dejo que todo el volumen fluya en la columna

Con la luz ultravioleta se observó la fluorescencia en el tubo 3 indicando la presencia de proteína GFP.
La medusa bioluminiscente Aequorea victoria provee una herramienta útil para la biología celular, una proteína que tiene la propiedad de emitir luz verde. La proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) ha sido modificada para emitir colores en muchas y diversas longitudes de onda. La GFP, junto con proteínas derivadas de otros organismos, ofrece nuevas variedades de proteínas fluorescentes. Entre otras características que la hacen, sin duda, especial, la proteína fluorescente destaca por no necesitar intermediarios para su expresión en cualquier organismo vivo, ser susceptible de modificación para mejorar su intensidad, cambiar colores de emisión, construir quimeras con otras proteínas y servir de gen reportero, sensor bioquímico y medidor sensible de pH intra e intercelular, etc. Desde su descubrimiento en 1962, la proteína ha sufrido muchos cambios y sus aplicaciones involucran todas las áreas de la biología. La neurociencia ha sido una de las más beneficiadas por los múltiples usos de la GFP. Uno de ellos ha sido marcar neuronas in vivo hasta con 90 colores fluorescentes, lo que ha permitido visualizar las redes de la arquitectura neural de un mismo organismo de una manera sin precedentes.