martes, 24 de mayo de 2016

electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) UA, Chile



REACTIVOS
-           -  Acrilamida
-          - Bisacrilamida
-          - Urea
-          - TEMED
-          - Persulfato de Amonio
-          - Buffer TAE 50X
-          - Agua Milli Q
-          - Formamida desionizada
-          - SYRB Gold o Red Gel (Biotium)

PASO 1
-          PREPARAR SOLUCIÒN A.B.A. 40% (Acrilamida/BisAcrilamida). La solución stock será de 50 mL.
-18,75 g de acrilamida
-0,5 g de Bisacrilamida
-50 mL de agua filtrada (0,22 µm) estéril

PASO 2
-          Con la solución stock ABA preparar solución stock (100%) y B (0%)

Solución A : 100 mL
   ABA : 18,8 mL
   Urea : 42 g (PM: 60,06 / mol)
   Formamida : 40 mL
   Buffer TBE o TAE 10X : 2 mL
  Agua destilada filtrada (0,22 µm) : 100 mL

Solución B: 100 mL
   ABA : 18,8 mL
  Buffer TBE o TAE 10X: 2 mL
  Agua destilada filtrada (0,22 µm) : 100 mL

Gradiente 60 %                                                                                                                                          9 mLsolución stock 80%                                                                                                                          3 mL solución stock 0%
Gradiente 40 %
6 mL solución stock 80%                                                                                                                            6 mL solución stock 0%
Agregar a ambas soluciones
TEMED : 11µL
APS : 100 µL

Protocolo PCR para hongos

- Agua miliQ   =   132 µL 
- Buffer PCR  =    50 µL
- MgCl2          =   20 µL
- Primer R     =    10µL Uni1392 reverse
- Primer F     =    10µL EuK1209F-GC

- dNTP = 5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra     =    2 µL
TOTAL     =     250 µL

Protocolo PCR para bacterias

- Agua miliQ   =   132 µL 
- Buffer PCR  =    50 µL
- MgCl2          =   20 µL
- Primer R     =    10µL 904R
- Primer F     =    10µL 341-GC
- dNTP =    5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra     =    2 µL
TOTAL     =     250 µL
















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