Microscopia Electronica de Barrido

electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) UA, Chile

REACTIVOS

-           -  Acrilamida

-          - Bisacrilamida

-          - Urea

-          - TEMED

-          - Persulfato de Amonio

-          - Buffer TAE 50X

-          - Agua Milli Q

-          - Formamida desionizada

-          - SYRB Gold o Red Gel (Biotium)

PASO 1

-          PREPARAR SOLUCIÒN A.B.A. 40% (Acrilamida/BisAcrilamida). La solución stock será de 50 mL.

-18,75 g de acrilamida

-0,5 g de Bisacrilamida

-50 mL de agua filtrada (0,22 µm) estéril

PASO 2

-          Con la solución stock ABA preparar solución stock (100%) y B (0%)

Solución A : 100 mL

   ABA : 18,8 mL

   Urea : 42 g (PM: 60,06 / mol)

   Formamida : 40 mL

   Buffer TBE o TAE 10X : 2 mL

  Agua destilada filtrada (0,22 µm) : 100 mL

Solución B: 100 mL

   ABA : 18,8 mL

  Buffer TBE o TAE 10X: 2 mL

  Agua destilada filtrada (0,22 µm) : 100 mL

Gradiente 60 %                                                                                                                                          9 mLsolución stock 80%                                                                                                                          3 mL solución stock 0%

Gradiente 40 %

6 mL solución stock 80%                                                                                                                            6 mL solución stock 0%

Agregar a ambas soluciones

TEMED : 11µL

APS : 100 µL

Protocolo PCR para hongos

- Agua miliQ   =   132 µL 
- Buffer PCR  =    50 µL
- MgCl2          =   20 µL
- Primer R     =    10µL Uni1392 reverse
- Primer F     =    10µL EuK1209F-GC
- dNTP = 5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra     =    2 µL
TOTAL     =     250 µL

Protocolo PCR para bacterias

- Agua miliQ   =   132 µL 
- Buffer PCR  =    50 µL
- MgCl2          =   20 µL
- Primer R     =    10µL 904R
- Primer F     =    10µL 341-GC
- dNTP =    5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra     =    2 µL
TOTAL     =     250 µL

ERROR

ERROR

ERROR

Nanodrop Epoch

Medición de ADN ng/µL

PCR para hongos

Protocolo R*PCR

- Agua miliQ = 132 µL 
- Buffer PCR= 50 µL
- MgCl2 = 20 µL
- Primer R=10µL Uni1392 reverse
- Primer F= 10µL EuK1209F-GC
-dNTP = 5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra = 2 µL
TOTAL = 250 µL

Mantener los reactivos y master mix en  hielo.

Para el Termociclador se alícuotar 23 μL de master mix en eppendorf de 0,2 mL, según las reacciones a realizar.  Adicionar 2 μL de templado en cada tubo de reacción.

2°  Se uso los siguientes Primer: Primer R=Uni1392 reverse y Primer F= EuK1209F-GC Forward

3° Se preparo el Master mix en eppendorf de 0,2 mL colocando los reactivos indicados en la tabla 

PROTOCOLO R*PCR:   PCR para 10 reacciones 25 µL c/u

4° Del Master mix se repartió a cada eppendorf 23 µL del master mix.                                              

5° Se colocaron las muestras a cada master mix.

PCR (rojo) calentamiento

PCR (enfriamiento)

Revisar:http://www.cmima.csic.es/pub/gasol/Manuals/Molecular_Ecology.pdf

Resumen:
- Primero se preparo el master mix en eppendorf de PCR equivalente a 10 reacciones
- Para cada eppendorf
23 µL Master Mix   +   2µL de muestra

Utilidades de cada reactivo del master mix
¿Que funcion cumple el buffer PCR?



¿Que funciòn cumple el MgCl en el PCR?
Es de las primeras cosas que ajustamos para una reacción de PCR que
no ha salido del todo bien. La polimerasa necesita de iones de magnesio
para funcionar adecuadamente y en general la concentración de 1.5 mM de
magnesio es la más común, pero puede probarse en un rango de 1 a 4 mM.
Mucho magnesio inhibe a la polimerasa, y poco puede generar productos
inespecíficos.

Otra escuela de pensamiento tiene que el aumento de Mg ++ aumenta la actividad de Taq (ADN - polimerasa dependiente de ADN ), pero a expensas de la especificidad , mientras que menos Mg ++ disminuye la actividad de Taq pero aumenta su especificidad. Así que el truco es saber lo mucho ( o poco ) a utilizar. Generalmente, 3 mM Mg ++ funciona bien para la mayoría de las mezclas maestras basadas en Taq ( utilizados para la PCR / qPCR ), aunque tanto como 5,5 mM Mg ++ ha sido utilizado con éxito en otras formulaciones Mastermix . Tal vez sólo tiene que utilizar pi mM ( 3,14159265359 mM Mg ++) y esperar lo mejor ~! ¿Quieres una buena actividad (productividad ), sino también una buena especificidad

Los dinucleótidos unen iones de magnesio. Para 1.5 mM de magnesio en
la reacción de PCR, una concentración ideal de dNTPs es de 200 μM. Pequeños
incrementos en la concentración de dNTPs pueden inhibir la reacción
porque atraparán el magnesio necesario para que la polimerasa trabaje. Si
cambiamos la concentración de dinucleótidos es importante tener en cuenta
que existe una relación entre las cantidades de magnesio y las de dinucleótidos
en la reacción. También es necesario saber que los dNTPs son muy inestables,
si se descongelan más de 3 a 5 veces pueden no funcionar tan bien. Por eso
recomendamos hacer pequeñas alícuotas, calculando que sirvan para 3 o 5
experimentos.

¿Cual es la funcion del buffer en el PCR
En general cada polimerasa viene con un buffer ya preparado con los
reactivos necesarios para que funcione de forma adecuada. Casi todos están
preparados con KCl y tris (un buffer 10X estándar contiene 500 mM KCl y 100
mM Tris-HCl, pH 8.3).