Nanodrop Epoch

Medición de ADN ng/µL

PCR para hongos

Protocolo R*PCR

- Agua miliQ = 132 µL 
- Buffer PCR= 50 µL
- MgCl2 = 20 µL
- Primer R=10µL Uni1392 reverse
- Primer F= 10µL EuK1209F-GC
-dNTP = 5 µL
- Taq Polimerasa= 2,5 µL
- Muestra = 2 µL
TOTAL = 250 µL

Mantener los reactivos y master mix en  hielo.

Para el Termociclador se alícuotar 23 μL de master mix en eppendorf de 0,2 mL, según las reacciones a realizar.  Adicionar 2 μL de templado en cada tubo de reacción.

2°  Se uso los siguientes Primer: Primer R=Uni1392 reverse y Primer F= EuK1209F-GC Forward

3° Se preparo el Master mix en eppendorf de 0,2 mL colocando los reactivos indicados en la tabla 

PROTOCOLO R*PCR:   PCR para 10 reacciones 25 µL c/u

4° Del Master mix se repartió a cada eppendorf 23 µL del master mix.                                              

5° Se colocaron las muestras a cada master mix.

PCR (rojo) calentamiento

PCR (enfriamiento)

Revisar:http://www.cmima.csic.es/pub/gasol/Manuals/Molecular_Ecology.pdf

Resumen:
- Primero se preparo el master mix en eppendorf de PCR equivalente a 10 reacciones
- Para cada eppendorf
23 µL Master Mix   +   2µL de muestra

Utilidades de cada reactivo del master mix
¿Que funcion cumple el buffer PCR?



¿Que funciòn cumple el MgCl en el PCR?
Es de las primeras cosas que ajustamos para una reacción de PCR que
no ha salido del todo bien. La polimerasa necesita de iones de magnesio
para funcionar adecuadamente y en general la concentración de 1.5 mM de
magnesio es la más común, pero puede probarse en un rango de 1 a 4 mM.
Mucho magnesio inhibe a la polimerasa, y poco puede generar productos
inespecíficos.

Otra escuela de pensamiento tiene que el aumento de Mg ++ aumenta la actividad de Taq (ADN - polimerasa dependiente de ADN ), pero a expensas de la especificidad , mientras que menos Mg ++ disminuye la actividad de Taq pero aumenta su especificidad. Así que el truco es saber lo mucho ( o poco ) a utilizar. Generalmente, 3 mM Mg ++ funciona bien para la mayoría de las mezclas maestras basadas en Taq ( utilizados para la PCR / qPCR ), aunque tanto como 5,5 mM Mg ++ ha sido utilizado con éxito en otras formulaciones Mastermix . Tal vez sólo tiene que utilizar pi mM ( 3,14159265359 mM Mg ++) y esperar lo mejor ~! ¿Quieres una buena actividad (productividad ), sino también una buena especificidad

Los dinucleótidos unen iones de magnesio. Para 1.5 mM de magnesio en
la reacción de PCR, una concentración ideal de dNTPs es de 200 μM. Pequeños
incrementos en la concentración de dNTPs pueden inhibir la reacción
porque atraparán el magnesio necesario para que la polimerasa trabaje. Si
cambiamos la concentración de dinucleótidos es importante tener en cuenta
que existe una relación entre las cantidades de magnesio y las de dinucleótidos
en la reacción. También es necesario saber que los dNTPs son muy inestables,
si se descongelan más de 3 a 5 veces pueden no funcionar tan bien. Por eso
recomendamos hacer pequeñas alícuotas, calculando que sirvan para 3 o 5
experimentos.

¿Cual es la funcion del buffer en el PCR
En general cada polimerasa viene con un buffer ya preparado con los
reactivos necesarios para que funcione de forma adecuada. Casi todos están
preparados con KCl y tris (un buffer 10X estándar contiene 500 mM KCl y 100
mM Tris-HCl, pH 8.3).

PREGUNTAS BIOLOGIA MOLECULAR. UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA, CHILE

¿CUALES SON LAS TÉCNICAS MOLECULARES QUE SE DEBE USAR PARA EVALUAR LA REPLICACIÒN, TRANSCRIPCIÓN, TRADUCCIÓN Y MODIFICACIONES POSTRADUCCIONAL IN VITRO?

Para la transcripciòn un metodo molecular es GRO/PRO-Sec y luego se puede usar qRT-PCR o secuenciaciòn

Para la transcripcion: RT-qPCR y la traducciòn: Western blotting

Revisar:
http://www.sciencemag.org/content/322/5909/1845.full.pdf

	Muestra	Protocolo	Resultado	Imágenes
Replicación	DNA molde
Transcripción	DNA + RNA polimerasa ARN transferencia	In vitro Gel de poliacrilamida y azul de metileno Resonancia Magnetica nuclear (RMN) y cristalografia de rayos X	Análisis de las proteínas de unión a ARN , para dilucidar la estructura del ARN por sondeo	RNA    DNA ____
Traducción	RNAm	Lisis celular + RNAm	Detección de proteína de interés por coloración. Ejemplo: GFP	Visualización de fluorescencia en proteínas
Modificaciones Post traduccionales	RNAt

Ejemplo de transcripción "in vitro", donde los transcriptos aparecen con flechas rojas de 205, 430 y 560 nt con los sitios de transcripción HindIII, Smal, Xmall ubicando los sitios de inicio de transcripción mostrando a la derecha en  electroforesis de gel de agarosa las longitudes de onda en nt y en 3b se agrego   α-amantina inhibidor de la transcripción específicamente inhibidor de la RNA polimerasa II. .

1. Dada la siguiente secuencia de DNA y la tabla del código genético (14 PUNTOS):

La caja de Pribnow (también  conocido como la caja de Pribnow-Schaller) es el TATAAT secuencia de seis nucleótidos (timina-adenina-timina-etc.) que es una parte esencial de un sitio en el ADN promotor para la transcripción que se produzca en bacterias. Es una secuencia de consenso idealizado o - es decir, que muestra la base más frecuente en cada posición en un gran número de promotores analizados; promotores individuales a menudo varían del consenso en una o más posiciones. También se conoce comúnmente como la secuencia -10, ya que se centra más o menos 10 pares de bases cadena arriba del sitio de iniciación de la transcripción.

La caja de Pribnow tiene una función similar a la caja TATA que se produce en los promotores en eucariotas y arqueas: está reconocida y unida por una subunidad de ARN polimerasa durante la iniciación de la transcripción. Esta región del ADN es también el lugar donde primero pares de bases separan durante la transcripción procariótico para permitir el acceso a la cadena molde. La AT-riqueza es importante para permitir esta separación, ya que la adenina y la timina son más fáciles de romper.

SECUENCIA PRIBNOW-BOX

 SECUENCIA SHINE-DALGARNO

El RNAm eucarionte funcional producido por el procesamiento de RNA retiene las regiones no codificantes de cada extremo, denominadas regiones no traducidas 5`y 3`(unstranslated regions, UTR). En el RNAm de los mamíferos, la UTR 5`puede ser de cien o màs nucleotidos de largo, y la UTR 3` puede ser de varias kilobases de longitud.   El RNAm procarionte a menudo también tiene regiones UTR 5`y 3`, pero son mucho mas cortas que la de los RNAm eucariontes y contienen menos de 10 nucleotidos.  

a) En la secuencia dada señale la ubicación de los siguientes elementos  y diga para qué sirven:

(-35)

Pribnow box (-10)

Shine-Dalgarno

Codón de inicio

Codón de término

UTRs

b) Debajo de la secuencia dada, escriba la secuencia de la hebra complementaria; señale cuál sería la hebra molde y cuál la hebra codificante. Señale el 5´y 3´ .

c) Escriba la molécula de mRNA resultante de la transcripción y señale el 5´y 3´

d) Escriba la secuencia de la proteína resultante de la traducción, y señale el amino-terminal y carboxilo-terminal

Nota: Las letras N significan nucleótidos desconocidos en la secuencia.

TACCCCTGATCAGTTACCCCTGATCAGTCGTCTAGCATGCGTCTAGCAAC

TTTTGCCTTAACGAGACTCCTGNNNNNAACTGATGCGGGCTGGCGCTCAT

CACCCTCCTCCACATTAAGATTATACGACGACACATCTGTACTGTACTGT

GACATGTTGTCAATCA

2. Esquematice una estrategia de clonamiento y expresión para el gen de la insulina humana en E. coli. Añada los pasos necesarios para comprobar si la clonación se realizó con éxito. Distinga los elementos y procesos relevantes.  NOTA: La insulina es una hormona peptídica secretada desde las células beta del páncreas cuya secuencia nucleotídica es conocida.

Los pasos llevados a cabo para la estrategia se clonamiento y expresión del gen de la insulina humana son los siguientes:
1º El gen de la insulina debe ser aislado de las células bacterianas. Un plásmido de ADN, que las replican en bacterias y son parte del cromosoma bacteriano.
2º El gen se inserta en el plásmido en donde es tomada por una bacteria.
3º Las bacterias se reproducen y comienzan a generar la proteína deseada.
La forma activa de la insulina consta de dos poli péptidos (A y B), que están separadas por partes codificadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener de cultivos de Escherichia coli separados.
El ADN que codifica para la cadena A de la insulina humana, y se inserta en un plásmido bacteriano. Se fabrica también ADN que codifica para la cadena B, y se inserta en otro plásmido similar al anterior. En ambos casos, el gen para la cadena de insulina se encuentra al lado del gen bacteriano para la ß- galactosidasa.
Los plásmidos se han introducido (por separado) en células de E. coli. Al expresarse, cada uno de ellos da lugar a una proteína de fusión, que contienen la cadena ß- galactosidasa unida a la cadena de insulina (A o B) mediante un residuo de metionina. (Figura 1)
Ambas proteínas de fusión se extraen y se purifican por separado, tratándose con BrCN, que destruye la metionina, quedando libres la cadena de insulina.
Se juntan las cadenas A y B, mediante procedimientos químicos (oxidación) se establecen en ellas puentes disulfuro, obteniéndose insulina en su forma final. (Finochieto et. al., 2008)
Los genes se clonan con la ß-galactosidasa en el plasmido pBR322. La recombinación de los plásmidos son amplificados en E. coli. Se lleva a cabo una transformación de la bacteria, en dos nucleótidos diferentes, luego la reacción entre la proteína ß-galactosidasa y el gen de la insulina con la metionina hace que el complejo proteico cambie, expulsando de esta manera la molécula de la metionina y produciendo al final la insulina con menos aminoácidos que al inicio del proceso por el método de la recombinación. (Figura 1 y 2)
El mecanismos de la separación de la insulina es a través del sistema RP-HPLC (Reverse-Phase High Perfomance Liquid Chromatography), la cual es utilizada para separar la insulina de otras especies, basada en una variedad de diferentes aminoácidos y gracias a la hidrofobicidad de la insulina relacionada con otros componentes. La tendencia de las proteínas debe ser generalmente con las proteínas más grandes que se encuentran en una fase estacionaria, en la cual tiene una gran limitación del soporte de alcalinidad. (Ladish & Kohlmann, 1992)

3.- En cuanto a los métodos de “screening” y selección de bacterias transformantes, diga en qué consisten y de un ejemplo de cada uno.  

https://www.youtube.com/watch?v=MvcG5ViJlVg
https://gen5fq.files.wordpress.com/2010/05/tarea-6-ingenieria-genetica.pdf
http://www.ugr.es/~mgarrido/Contenidos.htm

Los métodos screening consisten en un complejo de bacterias transformantes de las cuales solo en un cierto porcentaje de bacterias transformantes se da la expresión del gen que codifica la proteína, siendo los siguientes métodos:

a) Métodos screening alfa complementación: Es un método que sirve para saber si el plásmido insertado en la bacteria es un plasmido intacto o recombinante. Si se inserto un plasmido intacto se forman colonias azules dándose la alfa complementación por activación de la ß-galactosidasa, y si se inserto un plasmido recombinante se forman colonias blancas no dándose la alfa complementación, siendo éstas las colonias transformadas.
b) Métodos screening Fluorescencia: Es un método que indica la transformación de las colonias bacterianas por fluorescencia, mientras que las colonias no transformadas no presentan fluorescencia.
c) Métodos screening PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real: Este método es el mas exacto para detectar las colonias transformantes específicamente por qPCR en tiempo real, ya que es posibles usar cebadores que son específicos y complementarios al gen de interes que es utilizado como vector para la transformación de las bacterias.
a) Métodos screening alfa complementación:
El plásmido tiene un tamaño aproximado de 2,7 Kb y en su secuencia destacan dos genes que actúan como marcadores de selección. El IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido) es un análogo de la lactosa que no puede ser utilizado como fuente de carbono o energía por las bacterias. Cuando es agregado al cultivo de una bacteria que posee el operón lac, actúa inactivando al represor lacZ y por lo tanto induce la transcripción del operón lac. En primer lugar, un gen de resistencia al antibiótico Ampicilina (gen AmpR) que confiere a las bacterias que incorporan este plásmido resistencia a dicho antibiótico. El otro gen es el gen lacZ. Este gen codifica para la enzima β-galactosidasa que degrada la lactosa y otros β-galactósidos como el 5-Bromo-4-Cloro-3-Indol-β-D-galactósido (X-gal) siendo un sustrato cromogénico, el cual es convertido por la beta galactosidasa en un compuesto azul insoluble. Sin embargo, esta copia del gen del plásmido es defectuosa en 3´ y, por tanto, el polipéptido producido tras la expresión de este gen carece de actividad β-galactosidasa. Este plásmido se utiliza en experimentos de clonación para transformar células de Escherichia coli. Esta cepa de E. coli posee un gen lacZ defectuoso en 5´ aunque posee un codón AUG interno que permite el inicio de la traducción del mensajero lacZ, defectivo, en un polipéptido sin actividad β-galactosidasa. Cuando una célula E. coli es transformada con el plásmido intacto (sin inserción de DNA), los polipéptidos producidos por los dos genes lacZ defectuosos (el de la bacteria y el del plásmido), que carecían de actividad β-galactosidasa por separado, complementan (fenómeno conocido con el término α-complementación) y la célula ve restablecida la función β-galactosidasa dando lugar a colonias azules. Sin embargo, la complementación no ocurre si el plásmido introducido en la bacteria es un plásmido recombinante (con inserción de DNA). Ello es porque las diferentes dianas de inserción se localizan dentro del gen lacZ en lo que se conoce como polylinker (región rica en diferentes dianas de restricción únicas). Así, en un experimento de clonación, cualquier inserto de ADN foráneo interrumpiría el gen lacZ del plásmido y la bacteria con plásmido recombinante carecería de función β-galactosidasa como las bacterias E. coli sin plásmido dando lugar a colonias blancas (Langley et. al., 1975; Holland et. al., 2004; Fang & Landau 2007). (Figura 3)

b) Métodos screening Fluorescencia:
1.- Para la transformación de la bacteria Escherichia coli en el plasmido pGLO, los screening de las bacterias transformantes E. coli con las siguientes placas Petri: LB –pGLO; LB/Amp –pGLO; LB/Amp +pGLO y LB/Amp/Ara +pGLO donde en este caso observamos un screening cualitativo con las bacterias transformantes con expresión del gen que codifica la proteína se da en la placa LB/Amp/Ara +pGLO, observándose colonias verdes fluorescentes desarrolladas. Esto es porque el gen que codifica la proteína fluorescente, GFP, está situado cerca del gen de la beta lactamasa en el plásmido PGLO, que protege a las bacterias del antibiótico ampicilina. Cuando la célula produce beta lactamasa para desactivar la ampicilina, el gen GFP también fue transcrito, produciendo la proteína fluorescente observada. (Figura 4).
Figura 3. Métodos screening de alfa

Otros métodos screening de fluorescencia: Como ejemplo tenemos a unas cepas de hongos listados en la Tabla 1 que fueron evaluados por el método screening de fluorescencia para potencial de biocontrol utilizando un enfoque basado en GFP (proteína verde fluorescente). Dothistroma septosporum es el agente causal del tizón Dothistroma aguja de los pinos. Una proteína verde fluorescente (GFP) un método para evaluar el potencial de los microorganismos para el biocontrol de Dothistroma. La pantalla utiliza la expresión de GFP como un indicador de actividad metabólica en el patógeno y la selección de resistencia a higromicina para determinar si la interacción es fungistático o fungicida. Los resultados sugieren que seis de ocho aislamientos de Trichoderma prueban tener el potencial para controlar Dothistroma in vitro, a través de una acción fungicida. Debido a que D. septosporum produce una toxina de amplio espectro, dothistromin, la inhibición de Trichoderma spp. por D. septosporum se determinó mediante mediciones de la tasa de crecimiento en comparación con los controles (Tabla 1). El método GFP también se evaluó para determinar si era adecuado para la detección de bacterias como posibles candidatos de biocontrol. Aunque un método que implica indirecta contacto tenía que ser utilizado, dos de las cuatro cepas de Bacillus mostraron actividad antagonista contra D. septosporum in vitro, a través de un fungistático interacción. Las cuatro cepas bacterianas inhibidas D. septosporum crecimiento por 14,0 a 39,8%. Esta basado en las buenas prácticas agrarias-método representa un enfoque novedoso para la detección hongos y bacterias para la actividad antagonista. (McDougal et. al., 2011)


Tabla 1. La inhibición de cepas FBC por D. septosporum FJT20 y post - competición
fluorescencia GFP de FJT20 .

Un % de inhibición de crecimiento de las cepas FBC de Trichoderma por D. septosporum
(produce micotoxinas ; dothistromin ), calculado a partir de mediciones del crecimiento radial
en D. septosporum (datos no mostrados). Los valores son medidos en cuatro placas
replicadas ± estándar desviación.
Texto en negrita indica que no hay diferencia significativa (p< 0.05) entre el crecimiento de
Dothistroma. (Figura 5)
SCREENING DE FLUORESCENCIA
b ++; sin pérdida de la fluorescencia GFP.
b+ ; pérdida parcial de la fluorescencia GFP.
b- ; pérdida completa de la fluorescencia GFP.

La Fluorescencia GFP de colonias D. septosporum FJT20 observadas en el tiempo durante la interacción con hongos y el biocontrol de cepas bacterianas. ( A) Colonias D. septosporum FJT20 cubierto por cepas fúngicas FBC4 y FBC6. Las colonias observados bajo luz visible y UV , en diferentes tiempos indicados a la izquierda; y días después de la inoculación de la cepa BCA y grados centígrados (ºC) ++; sin pérdida de la fluorescencia de GFP , + ; pérdida parcial de la fluorescencia de GFP , - ; pérdida completa de la fluorescencia de GFP (del área de la colonia FJT20 invadido por la cepa BCA ) . c) Screening PCR En este estudio se presenta un enfoque alternativo para la detección de colonias utilizando PCR en tiempo real (qPCR ) que puede ser utilizado en lugar del PCR de punto final tradicional para eliminar los falsos positivos y reducir los tiempos de procesamiento. Los falsos positivos transformantes pueden distinguirse fácilmente de los verdaderos positivos mediante la comparación de los valores de Ct derivados de la amplificación de las curvas de qPCR. Además , el uso de qPCR permite un procesamiento más eficiente desde un paso de electroforesis en gel. En la siguiente figura se muestra los resultados de electroforesis en gel en 15 muestras seleccionadas al azar, en comparación con los resultados obtenidos usando PCR de punto final. Por qPCR, 10 de estas muestras fueron positivas para P2X7 y 5 fueron negativos. Sin embargo, se encontró que las 15 colonias blancas son positivo por PCR punto final y, además, ambas colonias azules no transformadas fueron también falsos positivos para el DNA; P2X7 por PCR de punto final. La secuenciación del plásmido minipreparaciones de cuatro de estas colonias positivas P2X7 y P2X7 por una colonia negativa confirmó la qPCR resulta ser correcta. Hemos encontrado que la detección de colonias qPCR nos permite rastrear un gran número de transformantes en un experimento. El número de muestras no está limitado por la capacidad del aparato de electroforesis en gel y esto nos permite analizar 72 muestras por qPCR comparando 20 muestras por PCR de punto final.(Skarratt & Fuller 2014).  (Figura 6)

4. En cuanto a la transfección de células de mamíferos.

a) ¿por qué se llama transfección?

Se llama transfección porque es la forma de optimizar la introducción del gen en células de mamíferos creando mejores resultados en las líneas celulares, de tal manera que no necesariamente va a ser óptima para otra línea celular por lo cual deben ser ensayados varios tipos de transfección escogiendo aquel que tenga mayor eficiencia, no existiendo todos lo atributos óptimos tales como: útil para transfecciones estables y transientes, fácil de realizar, de bajo costo y lo suficientemente versátil como para transferir cualquier tipo de célula. De forma general los métodos para transferir ADN en células de mamíferos se pueden dividir en tres grupos:

-       Transfección mediada por agregados inorgánicos (precipitación con fosfato de calcio).

-       Transfección mediada por polímeros catiónicos acoplados o no a grupos lipídicos (DEAE-dextrana, liposomas, polietilenimina y otros).

-       Transfección mediada por efectos físicos o mecánicos (fusión de protoplastos, electroporaciòn, micro inyección, bombardeo de microproyectiles recubiertos con ADN). (Castro & Portelles, 1997)

b) Explique una metodología utilizada para transfección transciente y otra para transfección estable.

- Transfección Transciente – Se da cuando el DNA no se inserta en el DNA genómico de la célula huésped -El DNA se pierde luego de la división celular con las ventajas de ser rápido y fácil y la Desventaja es que No se puede controlar la expresión de la proteína.

 La metodología que menciono trata sobre la respuesta antiviral, el cual se realiza una Transfección transciente con un reactivo lipofectamina TM2000 utilizando un plásmido o vector ECFP transfectando a las células Hela, luego esta célula Hela transfectada codifica un proteoma que desencadenan respuestas antivirales a partir del interferón I/II y participan en importantes procesos celulares como el empalme de ARN; Remodelación de la cromatina y el ciclo celular después de la traducción. Considero este estudio muy importante ya que las transfecciones transcientes han recibido menos atención y tales conocimientos no han sido analizados en el nivel proteoma. (Hagen et. al., 2015) (Figura 7)

-       Transfección Estable: El DNA se inserta en el genoma de la célula huésped - La presión de selección mantiene el DNA foráneo cuyas ventajas son generar una línea celular que puede ser mantenida y que todas las células expresan la proteína al mismo nivel y la desventaja es que requiere más tiempo para el establecimiento de la expresión estable y no se puede controlar el lugar donde se inserta el DNA foráneo. La metodología que menciono es la Transfección estable de genes a células madres derivadas de las célula adiposas, el cual es muy difícil transfectar DNA estable a las células madres para lo cual se usa un péptido conjugado denominado polietilenimina(PEI) mas DNA transfectando a la célula madre y a la vez para evaluar la eficiencia de la transfección se inserto el vector pGL3 que expresa la proteína GFP (proteína fluorescente verde modificada) codificando una alta expresión de genes manifestando fluorescencia con una mayor actividad luciferasa durante un prolongado tiempo en células derivadas de tejido adiposo (Figura 8). (Park et. al., 2015)

5.    En la transformación de una célula de planta por Agrobacterium tumefaciens a través del plasmidio Ti natural:

a.    Dibuje un esquema de un vector Ti natural y uno construido para transformación génica de plantas indicando sus elementos principales y diga brevemente su función.

ü DNA-T:  Es el inductor de tumores del plásmido Ti, transfiriéndose al genoma del núcleo de la planta. El DNA-T es el elemento móvil responsable de la formación de tumores, delimitado por repeticiones de 25pb pares de bases (borde derecho e izquierdo)

üRegión Vir: Contiene aproximadamente 35 genes de virulencia agrupado en ocho operones (VirA, VirB, VIRC, VirD, VirE, virG, VirF y VirH).

ü La otra región contiene genes que participan en el metabolismo de opina. (Figura 9)

 El vector construido es un vector binario que contiene dos orígenes de replicación, un origen de replicación para Escherichia coli y otro para Agrobacterum tumefaciens, carece del de la región Vir (Figura 10)

b.    Explique claramente los pasos de la transferencia de ADN en forma natural (Sin manipulación), y las funciones de las moléculas implicadas. (genes vir, acetosiringona, Ti, auxina, citoquinina, etc).

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria de suelo Gram negativos(-) y patógeno de plantas angiospermas y gimnospermas siendo su patogenicidad por mecanismos moleculares por el segmento de DNA (DNA-T) en un plásmido inductor de tumores (Plásmido Ti 214 kb) que se transfiere de la bacteria al genoma de la planta huésped mediante un sistema de secreción de tipo IV asemejándose estrechamente a una transferencia conyugal bacteriana cuyo fenotipo es la expresión de genes bacterianos DNA-T estimulando el exceso de producción de hormonas de crecimiento de plantas como la citoquinina y auxina

 Los mecanismos por el cual se inserta el material genético de la bacteria a la célula de la planta:

Paso 1. El tratamiento y la transferencia de DNA-T están mediados por productos codificados por la región vir (virulencia), que es también residente en el plásmido Ti.  Esos genes vir, cuyos productos están directamente involucrados en el tratamiento y la transferencia de DNA-T, están estrictamente regulados por la expresión que se produce solamente en presencia de células vegetales heridas, con el control de la expresión génica que está mediada por las proteínas VirA y VirG , dos componentes del sistema de regulación VirA detecta los compuestos fenólicos pequeños liberados por plantas heridas resultantes de la autofosforilación. 

Paso 2. Después de la inducción de los genes Vir,  comienza con la generación de la hebra T , una copia ss del DNA- T. El VirDl y VirD2 son esenciales para este proceso (Filichkin y Gelvin , 1993 ). Juntos, VirDl / D2 reconoce la secuencia de borde 25 –bp y produce una escisión endonucleolítica ss en el cadena inferior de cada frontera

Paso 3. La hebra T debe viajar a través de numerosas membranas y los espacios celulares antes de la llegada en el núcleo de la planta. Por lo tanto, para preservar su integridad , se planteó la hipótesis de que la hebra T probablemente viaja como un complejo ssDNA - proteína. VirE2 es una proteína de unión a ácido nucleico ss inducible codificada por el locus VirE que se une sin especificidad de secuencia. VirE2 se une fuertemente, que significa que una hebra T  sería completamente recubierta.

Paso 4. Por consiguiente, la degradación por nucleasas impedirá la unión in vitro de VirE2 y DNAss resistentes a la degradación nucleolítica . Por último , la unión de VirE2 se despliega y se extiende sobre DNAss a un diámetro estrecho de 2 nm , lo que puede facilitar la transferencia a través de los canales de la membrana. La hebra T junto con VirD2 y VirE2 son denominados complejo-T. Posteriormente, el complejo T debe salir de la célula bacteriana, pasando a través de las membranas interna y externa así como la pared celular bacteriana. A continuación, debe cruzar la pared celular vegetal y de la membrana

Paso 5. Una vez dentro de la célula de la planta , el complejo T pasa al núcleo de la célula vegetal y atraviesa la membrana nuclear

Paso 6 , Luego el complejo T se integra en el cromosoma de la planta. (Zupan, & Zambryski, 1995)

Un modelo simplificado del proceso de transformación mediada por Agrobacterium. El proceso de transformación compleja y aún no totalmente descifrado puede, por razones didácticas, ser diseccionado en varios pasos distintos.

 (1) Las moléculas de señal liberadas de los tejidos vegetales heridos son reconocidos por las bacterias Agrobacterium  del sistema de transducción de los componente de señales VirA / VirG2.

(2) Las señales moleculares son reconocidas por receptores de la bacteria.  

(3) El agrobacterium ataca a las células de la planta

(4) La activación de los genes Vir conduce a las endonucleasas específicas VirD1/VirD2 dirigidas a la secuencia DNA-T. Se procesan el DNA-T del plásmido Ti y se liberan una sola hebra de ADN-T (ss) a través de un mecanismo de reemplazo de cadena.

(5) Después, la proteína VirD2 se une con enlace covalente polar al DNA-Tss (formando el complejo inmaduro "T (5). El conjugado VirD2 / T-hilo es entonces transferida al citoplasma planta a través de un sistema de secreción de tipo IV (T4SS) formado por 11 proteínas VirB y VirD4.

(6) A través de este aparato de secreción, localizada predominantemente en el polo de bacterias, el DNA-T que contiene el paquete se inyecta en la célula de la planta y pasa a través de tres membranas, la pared celular de la planta y espacios celulares, mediante el uso de la misma ruta, otras proteínas de virulencia bacteriana (VirE2, VirE3, VirF y VirD5) que sirven el proceso de transformación en la planta, se exportan a la célula vegetal. El complejo "T” maduro se cree que está montado dentro de la célula huésped mediante la asociación de la VirD2 conjugado con el complejo inmaduro "T” con VirE2.

 (7). Se ha sugerido que VirD2 y VirE2 protegen al complejo maduro-T del ataque exonucleolítico dentro del citoplasma de la planta. Tanto las proteínas de VirD2 y VirE2 contienen señales de localización nuclear y sirve como proteínas piloto para guiar el "complejo-T maduro" al núcleo central. Pasando la membrana nuclear y la orientación al sitio de integración dentro del núcleo requiere una acción cooperativa de los factores bacterianos y vegetales, con el VirF, VirD2 y VirE2. Dentro del núcleo, las proteínas conjugadas al complejo maduro T se liberan a través de proteólisis dirigida convirtiéndose en una molécula de doble cadena. Posteriormente, encuentra su lugar en la cromatina huésped y se integra en el genoma de la celula vegetal huésped.

(8). Siguiendo con éxito la integración, la expresión de genes de DNA-T codificada conduce a la síntesis de proteínas bacterianas con la formación de tumores o agallas en los tejidos vegetales. (Figuras 11 y 12)(Stachel y Nester, 1986;  Pacurar, et. al., 2011)

c.    Después de la transformación de la célula vegetal ¿dónde se localiza el DNA foráneo transferido?.

En el genoma de las células vegetales  

d.    ¿Qué se entiende por “evento de transformación”?
Evento de transformación se entiende a todo los procesos que involucra el ataque de la bacteria a la celula huésped, transfiriendo al DNA de la bacteria a la celula vegetal huésped provocando cambios fisiológicos de la celula vegetal transformada produciendo nuevas sustancias como principalmente las proteína con o sin transmisión de generaciones sucesivas

Bibliografia

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Park, E.; Cho; H.B.;Takimoto, K. 2015.  Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy; 17: 536-542.

Castro, F.; Portelles, Y. 1997. Transfección de ADN a células de mamíferos. Biotecnología aplicada. 14: 149-161.

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